Danish Medical Bulletin    |    Contact Front page  

 
APOPTOSIS REGULATION IN ULCERATIVE COLITIS

Jakob Benedict Seidelin  


  Download file   ( KB)

Accepted by: Faculty of Medicine University of Copenhagen
Defended on: September 16, 2004
Official opponents: Mogens Claësson , Jens Frederik Dahlerup , Ebbe Langholz
Tutors: Ole Haagen Nielsen , Marja Jäättela

Published in the PhD Database: January 11, 2005


English abstract
Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory bowel disease characterised by the extravasation of cytokine producing immunocompetent cells into the lamina propria and increased epithelial apoptosis. The epithelial apoptosis causes increased leakiness of the epithelium and allows pathogens to invade the mucosa resulting in a sustained antigen drive that contributes to the chronic inflammation. The aim of this thesis was to establish a method for the study of apoptosis regulation in vitro in isolated human epithelial cells obtained by routine colonoscopy and to apply this method to the study of apoptosis regulation in UC.
Chelation temperatures and times of biopsies were optimised by evaluating the morphology and quantity of liberated crypts. Three different culture protocols were then compared and the effect of addition of growth factors, high oxygen partial pressure, and conditioned growth medium on culture viability assessed. Crypts grown in a three dimensional collagen gel on a porous membrane were found to be more viable than cells grown according to the other protocols tested. No effects of oxygen or growth factor supplementation were found.
Subsequent evaluation of the expression profile of apoptosis related genes were performed using a macro gene array containing probes for 96 cell death related genes and 4 housekeeping genes. This showed that only 3 genes were found to be overexpressed in UC: The inflammatory caspases 1 and 5, and the inhibitor of apoptosis protein 2 (cIAP-2). Caspases 1 and 5 are most likely involved in cytokine processing and secretion and not in apoptosis, whereas cIAP-2 may be involved in the regulation of apoptosis responses to external stimuli such as the death inducing ligand CD95L. In functional studies, the response to CD95L was indeed found to be reduced in UC. These studies points to a cytoprotective response to cytokines in colonocytes from humans and contrasts the findings from cell line studies.
The exact role of cIAP-2 regulation in colonocytes has to be established and the possible consequences for initiation of cancer to be elucidated.



Danish abstract
Colitis ulcerosa (blødende tyktarmsbetændelse, UC) er en kronisk sygdom i tarmen, hvor slimhinden fyldes med hvide blodlegemer, og hvor slimhindens overfladeceller tager skade som følge heraf. Overfladecellerne dør ved en proces som kaldes apoptose, eller programmeret celledød, og dette bevirker, at det underliggende bindevæv udsættes for bakterier og føderester i tarmen, hvilket kan være med til at vedligeholde betændelsen.
Formålet med undersøgelserne var at undersøge celledødsmekanismerne i disse overfladeceller (epitelceller). De tilgængelige metoder til dyrkning af slimhinde-overfladeceller fra mennesker er imidlertid ikke anvendelige til dette formål, idet cellerne dør spontant, når de fjernes fra deres normale miljø. Derfor udvikledes en metode til isolering af epitelcellerne og med dannelse af kunstigt omgivende bindevæv.
Det blev vist, at den bedste isoleringsprocudure til formålet involverer anvendelse af chelerende stoffer, som frigører epitelcellerne fra det underliggende væv, og de optimale fysiske og kemiske betingelser blev bestemt. Den bedste metode til at holde de isolerede celler i live var at indstøbe dem i en tredimensional gel bestående af kollagen sat på en porøs membran.
Gener med betydning for apoptoseregulering ved UC blev fundet ved at måle udtrykket af 96 gener, som vides at være involveret i celledød i epitelceller. Det vistes, at tre gener var overudtrykt ved UC, nemlig caspase 1, caspase 5 og inhibitor of apoptosis protein 2 (cIAP-2). De to førstnævnte er højst sandsynligt involveret i forarbejdelsen af betændelsessignalstoffer og ikke primært i celledød, mens cIAP-2 vides at være central for, hvordan tyktarmens epitelceller reagerer på udefrakommende celledødssignalstoffer, eksempelvis CD95L. I relation hertil blev det også vist, at følsomheden for CD95L faktisk var nedsat.
Den egentlige betydning af cIAP-2 for celledødsregulering i tyktarmsepitelceller fra patienter med UC skal undersøges yderligere, fordi de nævnte studier ikke giver direkte bevis for, at der er en sammenhæng mellem opregulering af cIAP-2 og nedsat apoptose. Celler med DNA-skade kan blive til kræftceller, men bliver normalt sorteret fra ved at cellen dør ved apoptose. De beskrevne ændringer i apoptoseresponset ved UC kan derfor have betydning for udvikling af tyktarmskræft ved UC. En sådan sammenhæng skal endvidere belyses.