Danish Medical Bulletin    |    Contact Front page  

 
In situ detection of RNA using Circle Probes and rolling circle DNA synthesis

Magnus Stougaard  


  Download file   ( KB)

Accepted by: Faculty of Health Sciences University of Aarhus
Defended on: January 18, 2008
Official opponents: Anders L. Nielsen , Eigil Kjeldsen , Hans J. Tanke
Tutors: Joern Koch , Steffen Junker , Torben H. Jensen

Published in the PhD Database: January 24, 2008


English abstract
This PhD thesis has been made at the Institute of Pathology, University hospital of Aarhus. The aim was to develop an in situ detection method using circular in situ hybridization probes (Circle Probes) in combination with target primed rolling circle DNA synthesis for detection of RNA. This has resulted in two new Circle Probe designs, the Turtle Probe and the Slicer Probe.

Initially we designed the Turtle Probe and used it for detection of non-polyadenylated RNA species (rRNA, EBER1 and hTR). The probes were hybridized to the 3¿-part of the target RNA, ligated to form a closed DNA circle, and then the rolling circle DNA synthesis was performed primed from the 3¿-end of the RNA. Rolling circle DNA synthesis results in a tandem repeat with a sequence complementary to the probe and can easily be detected by FISH. Because the rolling circle DNA synthesis was primed from the 3¿-end of the RNA, the rolling circle product was covalently anchored to the RNA ensuring prefect signal localization. Thus, ISH with Circle Probes and target primed rolling circle DNA synthesis requires both hybridization of the probe and the presence of a 3¿-end in the target RNA, to prime the rolling circle reaction and is therefore less prone to non-specific signals where probe molecules stick or hybridize non-specifically in the specimen.
However, a different approach is needed if the target RNA is polyadenylated or if the existing 3¿-end is not an option, e.g. if the detected sequences is located in the midst of an RNA molecule. For this we designed the Slicer Probe, which is a Circle Probe containing a DNA enzyme. DNA enzymes are DNA sequences capable of performing specific chemical reactions using divalent metal ions as co-factors. Inclusion of a DNA enzyme in the footprint of the probe enables the probe to cleave the target RNA, thereby generating a new 3¿-end at the hybridization site. This new 3¿-end can be used for priming the rolling circle DNA synthesis, and the rolling circle product detected by FISH.



Danish abstract
Denne PhD afhandling er udfærdiget ved Patologisk Institut, Århus Universitetshospital, Århus sygehus. Formålet med PhD projektet var at udvikle en sensitiv in situ detektionsmetode som, ved brug af Cirkel Prober og rullende cirkel DNA syntese, kunne bruges til detektion af enkelte RNA-molekyler. Dette har resulteret i to nye Cirkel Probe design, Turtle Proben og Slicer Proben.

Den første probe type vi udviklede var Turtle Proben, som vi har brugt til detektion af ikke polyadenylerede RNA-molekyler (rRNA, EBER1 og hTR). Proberne blev hybridiseret til den 3¿-terminale ende af RNA-molekylet, ligeret til en lukket DNA cirkel og rullende cirkel DNA syntese blev påbegyndt, primet fra 3¿enden af RNA-molekylet. Rullende cirkel DNA syntese resulterer i et langt stykke DNA bestående af repeterede sekvenser med en komplementær sekvens af proben og dette repeterede DNA kan nemt detekteres ved hjælp af FISH. Da den rullende cirkel DNA syntese er primet fra 3¿-enden af RNA-molekylet vil den repeterede sekvens desuden blive kovalent bundet til 3¿-enden af RNA-molekylet, hvilket sikre en perfekt signal lokalisering. På grund af at denne metode kræver både hybridisering og tilstedeværelsen af en 3¿-ende i RNA-molekylet, vil risikoen for uspecifikke signaler hvor proben klistre eller binder uspecifikt i præparatet minimeres.

Hvis RNA-molekylet man vil detektere er polyadenyleret eller den eksisterende 3¿-ende af RNA-molekylet ikke kan bruges til at prime reaktionen, eksempelvis hvis sekvensen man vil detektere er midt i RNA-molekylet, er det nødvendigt at bruge en andet type Cirkel Probe. For dette formål har vi designet Slicer Proben, som er en Cirkel Probe indeholdende et DNA-enzyme. DNA-enzymer er DNA-sekvenser som, ved hjælp af divalente metal ioner som co-faktorer, kan udføre specifikke kemiske reaktioner. Ved at inkludere et DNA-enzyme i den hybridiserende del af proben bliver proben i stand til at kløve RNA-molekylet og derved genererer en ny 3¿-ende på hybridiseringsstedet. Denne nye 3¿-ende kan så bruges til at prime den rullende cirkel DNA syntese, hvis produkt efterfølgende detekteres med FISH.